jGCaMP7——高性能基因编码钙离子探针

利用基因编码钙指示剂(genetically encoded calcium indicators,GECIs)测量神经元活动已成为神经科学中广泛使用的方法,GECIs进行钙成像通常用于测量完整神经系统的神经活动,如检测大量神经元胞体的活动,或追踪神经元亚细胞(如轴突、树突和单个突触)的动态。尽管取得了重大进展,但钙成像仍然受到现有GECIs的生物物理特性的限制,包括亲和力、信噪比、灵敏度、半衰期以及动态范围,因此,GECIs在这些方面还有待改进。

        2019617日,来自霍华德休斯医学研究所的Karel Svoboda、Loren LoogerVivek Jayaraman等课题组合作的“GENIE项目组在顶级期刊Nature Methods上发表了题为“High-performance calcium sensors for imagingactivity in neuronal populations and microcompartments”的研究成果。该论文系统地介绍了新一代基因编码的钙离子探针jGCaMP7系列,专门用于检测特定环境下的神经元活动。jGCaMP7包括:jGCaMP7s(灵敏)、jGCaMP7f(快速动力学)、jGCaMP7b(较亮的基线荧光)jGCaMP7c(高对比度)。jGCaMP7在体内和体外都进行了测试,其性能明显优于GCaMP6。

研究人员利用在存在或不存在Ca2+GCaMP的晶体结构,确定了可能影响指示剂关键性质的位置,包括静息荧光和峰值荧光,以及结合和不结合Ca2+的亲和力和动力学。GCaMP包括一个与钙调蛋白(CaM)融合的环状排列GFP(cpGFP)和一个来自肌球蛋白轻链激酶(Rs20,也称为M13)的钙调蛋白结合肽。钙调蛋白依赖的构象变化及其与M13GFP的相互作用调节GFP发色团环境并影响荧光。对GFP-CaM接口和CaM-M13相互作用接口进行了定点突变(1a)。通过电极刺激培养的神经元筛选662个变异的jGCaMP7(1c),继续在体外特性研究中得到了性能优良的jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7bjGCaMP7c。其中,jGCaMP7s灵敏性可达GCaMP6s的5倍以上,且速也快于GCaMP6sjGCaMP7b灵敏度达到GCaMP6s3倍,荧光亮度增强50%jGCaMP7c灵敏度是GCaMP6s的2.7倍,且对比度增强;jGCaMP7f反应速是GCaMP6f 的5倍及GCaMP6s的3(2)。

1. 分离神经元中jGCaMP7的突变与筛选

2. jGCaMP7的筛选及体外特性研究

通过优化钙离子探针的Ca2+亲和力同时进一步提高探针的灵敏度、信噪比、半衰期和动态范围,研发出了jGCaMP7系列。追神经元亚细胞的动态对神经环路研究具有重要意义,而树突、轴突等亚细胞结构小,jGCaMP6灵敏度低,成像保真度不高,而jGCaMP7s,jGCaMP7f,jGCaMP7b很大程度上提高了在不同钙离子浓度下的灵敏度,jGCaMP7f同时具有较快的反应速率,这对于神经元亚细胞的动态检测非常重要。

研究人员随后在在体水平验证了jGCaMP7。在检测jGCaMP7在成年果蝇椭球体神经元的表现中,检测对于闭环视觉刺激下的运动果蝇的树突神经活动,通过双光子成像发现jGCaMP7f相比GCaMP6f表现出更高的检测灵敏度(3)。通过对小鼠初级视觉皮层双光子成像中,发现jGCaMP7b相比于GCaMP6s能够在更多的树突棘中检测到对视觉刺激的反应(4)。

3. jGCaMP7在成年果蝇椭球体神经元中的表现

4. 树突棘中钙信号的检测

目前jGCaMP7已经被广泛用于线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等多个模式生物的研究。未来GCaMP的改进可能需要最大限度地增加其荧光强度,这将需要对GCaMP骨架进行重大改变,例如用更明亮的荧光蛋白取代cpGFP,用cpGFP发色团重新设计CaM-M13接口,或者使用完全不同的荧光基团。

枢密科技jGCaMP7系列钙离子探针列表:

产品编号 产品名称 启动子 Cre/Flp依赖
PT-1421 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7s CAG Cre依赖
PT-1422 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7f CAG Cre依赖
PT-1423 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7b CAG Cre依赖
PT-1424 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7c CAG Cre依赖

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